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Nanoporeに挑戦する話(下準備編)

いままで散々ショットガンシーケンスで読んだ配列からゲノム構築をやろうと試みてきましたが、結局のところ「無理なものは無理」という結論に達したM2の冬。

しかし、なんとこの春、共同研究を組んでいる研究室に最近噂のナノポアが導入されることに!しかも先生が「回してもいいよ~」というので、これはナノポアでロングリードを読んで足場構築しつつショットガンシーケンスの配列で補正するアセンブリができる!!!!ヤッタ~~~~!!!!と大喜びでナノポアを回すことに相成りました。キャッキャ

しかし、スターターパックに必要な試薬は全部入ってると聞いてよく下調べもせずに挑戦しようとした結果…今回買ったスターターパックに入っているキット(後述)は1000ng以上gDNAがいるらしい。わたしの対象種、ちっちゃい虫!1000ngは無理!というので、ナノポア回すのは見送りに。とほほ。

仕方ないので、次はこういうことが無いように、スターターパックとキットを調べてみることにしました。

 

スターターパックの中身

今回先生が買ってくださったキットはこちら。

store.nanoporetech.com

Package Includes:

1x MinION Sequencing Device MIN-101B

ナノポアシーケンサー本体
1x Included kits

選べるキット
1x Flow Cell Wash Kit EXP-WSH004

フローセルを洗うキット
1x Control Expansion EXP-CTL001

ワークフロー評価のためのコントロール試薬
1x Nanopore Workshop SUPP003

ナノポア・シーケンシングとデータ解析のエッセンスを学べるオンラインワークショップ
Choose between either:

フローセル本体
  4x Flow Cell (R9) FLO-MIN106D or
  4x Flow Cell (R10) FLO-MIN111

 

Included kitsとして先生はLigation Sequencing Kitを選択されていました。

まず、わたしのサンプルに合うキットを注文してもらうところから始めなくてはいけません。

 

ナノポアのキットの種類store.nanoporetech.com

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https://nanoporetech.com/products/kits

できればアンプリコンシーケンス(PCRで増やしてから読む)はしたくないのですが、アンプリコンシーケンスでない右の二つはかなりgDNA の量が要るみたいです。

わたしのサンプルはかなりgDNA少なめ(100ng強)なので、PCR Sequencing Kit(SQK-PSK004)が安牌なのかなぁ。

 

PCR Sequencing Kit について

このキットでは上図右の二つのアンプリコンシーケンスの内、より長いリードが得られるようです。

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Typical read-length histograms observed when preparing libraries with the PCR Sequencing Kit (A) and the Rapid PCR Barcoding Kit (B).

一連の流れ (Nanopore Store (nanoporetech.com))

断片化

末端処理&dA付

PCR用アダプター配列のライゲーション(結合)

Rapid Sequencing Adaptersを装着用配列を含むプライマーを使ってPCR

Rapid Sequencing Adapterを装着

MinION で読む

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Workflow of PCR Sequencing Kit

 そもそもNGS のライブラリ作製がわからん!という人、この記事を書く過程で比較的わかりやすいページを見つけたので置いておきます。

NEBNext DNA ライブラリー調製

 

 

 

PCR Sequencing Kit に含まれる試薬

1.シーケンスライブラリ作成用試薬

WGP:Whole genome primers
PCA:PCR adapter
RAP:Rapid adapter
SQT:Sequencing tether
LB:Loading beads
SQB:Sequencing buffer

2.Flow Cell Priming Kit Expansion Pack
FB:Flush buffer
FLT:Flush tether

 

PCR Sequencing Kitに含まれないが、必要な試薬

Agencourt AMPure XP beads  PCR産物精製
NEBNext End repair / dA-tailing Module (E7546) ライブラリー調製(エンドリペアおよびdAテーリングステップ)

NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (E7546) - New England Biolabs Japan (nebj.jp)

NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (M0367) 平滑末端/TAのライゲーション効率を向上できるリガーゼ・マスターミックス

Blunt/TA Ligase Master Mix (M0367) - New England Biolabs Japan (nebj.jp)
1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes 1.5mmチューブ
0.2 ml thin-walled PCR tubes 蓋つきチューブ
Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, cat # AM9937) 蒸留水
Freshly prepared 70% ethanol in nuclease-free water  70%エタノール
LongAmp Taq 2X Master Mix (e.g. NEB M0287) 長いターゲットを増幅するPCRマスターミックス

LongAmp Taq 2X Master Mix (M0287) - New England Biolabs Japan (nebj.jp)
10 mM Tris-HCl pH 8.5 with 50 mM NaCl トリス塩酸緩衝液(バッファー)

 

オプションの消耗品

  • Covaris g-TUBE
  • Exonuclease I (NEB, M0293)

 あとは、どれがあってどれがないのかを確認して注文してもらえば今度こそ回せるはず…。

 

つづく!